BEAMSBIO Long PCR Master Mix (2X)

Store at –20℃ for storage, but 4℃ for daily or weekly use
#3303 5ml	4vials of 1.25 ml/vial : 5 ml for 500 reactions of 20 µl. Supplied with 0.3 ml of loading dye(x6)
* Recipe :  Optimal Blend of Taq DNA Polymerase & Pfu DNA Polymerase, 1.6 mM dNTP mix and 2x Reaction buffer

Features

l      Enzyme mix optimized blend of Taq DNA Polymerase & Pfu DNA Polymerase

l      Reproducible, nuclease-free, minimizing pipetting error & tedious manipulation

l      PCR products with mix of blunt ends and 3’-dA overhangs. TA cloning is possible. But 3’-dA overhangs with Taq Pol. or blunt-end cutting prior cloning recommended

Description

Long PCR Master Mix (2X) is a 2X concentrated solution including unique blend of Taq DNA Polymerase and Pfu DNA polymerase with 3’à5’ exonuclease proofreading activity, dNTPs and the reaction buffer for PCR. The BEAMSBIO Long PCR Master Mix(2x) facilitates PCR formulation and minimizes error and inconvenience in PCR operation. The unique blend of two enzymes synergistically enable longer PCR with greater yield and fidelity than Taq DNA Polymerase alone, showing more than four-times the fidelity of Taq DNA Polymerase

Applications

l        PCR products with high fidelity for cloning, expression, site-directed mutagenesis.

l        Generating mainly 3'-dA tailed PCR products and partly blunt-ended

l        PCR with high reproducibility & higher yields,

l        High throughput & long range PCR, RT-PCR.

Quality Control

The BEAMSBIO Long PCR Master Mix(2x) is confirmed free of endodeoxyribonucleases, exodeoxyribonucleases and ribonucleases by strict quality tests, which shows satisfactory PCR results upto 30 kb with viral DNA templates and up to 10 kb with genomic DNA templates.

Mg²⁺ conc. in Long PCR Master Mix

Mg²⁺ conc. is 4mM in our Long PCR Master Mix.  To amplify cDNA, Mg²⁺ may need to be added to a final 3mM in each PCR reaction mixture.

PCR Protocol using Long PCR Master Mix

1. Prepare PCR tubes for the experimental samples to be amplified.
증폭할 실험시료에 적합한 PCR튜브를 준비한다.

2. Add the components in order according to following recipe :
다음 성분표를 참조하여 실험용 재료를 순서대로 넣는다.

  Distilled water,                                       17~24 ㎕ *(balance to total vol. 50㎕)
  Long PCR Master Mix,                                25 ㎕ (투입 후 가볍게 섞는다)
  DNA templates(10~200ng/㎕),             0.2~1 ㎕
  Primer, forward(10pmol/㎕),                 0.2~2 ㎕
  Primer, backward(10pmol/㎕),             0.2~2 ㎕
-----------------------------------------------------------------------------
                                                            total     50 ㎕
 * Primers(template와 미리 배합 사용가능)를 마지막에 넣는 것이 좋다.
 * Magic buffer,   2~5 ㎕ (필요 시에만 적량 사용)

3. Mix gently and rapidly. Centrifuge down PCR tubes immediately after mixing.
가볍고 신속하게 섞고, 즉시 짧게 원심분리하여 반응물을 아래로 모은다.

4. Perform PCR using optimized cycling conditions.  Suggested cycling parameters for PCR using PCR Master Mix are :
다음 운전조건을 참조하여 Long PCR Master Mix 최적 PCR운전조건을 설정하여 실험을 수행한다.

  - Step 1 :  initial denaturation,              94~95℃ for 2~5 min.
  - Step 2 :  denaturation,                          94℃ for 45 sec.
                    annealing,                              Tm-5℃ for 45 sec.
                    extension,                              68~74℃ for 0.5~1 min/kb
                     * 10~15싸이클 수행 후 20~30초씩 늘려가면서
                        15~20 싸이클 추가로 수행함(조건 최적화 필요)
  - Step 3 :  final extension,                          72℃ for 5~10 min.

5. Cool down below 15℃ until harvest.

Long PCR Troubleshooting

1. PCR band가 전혀 없는 경우 :
- Primers, template DNA 배합에 착오가 없는지 확인한다.  성분누락 여부 ?
- PCR 운전조건이 적합하였는지 확인한다.  PCR반응기 운전 실수 여부 ?
- Primers Design 적합 여부?
- GC-rich DNA 등 고난이도 증폭시에는 magic buffer를 5~20%정도 사용
 * 주의 : magic buffer는 예외적인 경우에만 선별적 사용함.

2. PCR band가 뿌옇게 끌릴 때 :
- Target band보다 아래쪽에서 작은 non-specific band가 많이 관찰될 때는,
             . primer design을 재검토한다.
             . DNA template 불순물이 높으면 순도를 높인다.
             . annealing temp.를 1~2℃ 높여 본다.
             . extension 온도를 조금 높이거나 반응시간을 조금 늘린다
             . 길이가 길거나 증폭이 어려운 DNA template이라면 Long PCR
               Master Mix로 변경하여 다시 시도한다.
- Target band보다 전체적으로 끌릴 때는,
             . PCR반응온도를 조정한다. Annealing 온도를 Tm-5℃ 부근에서
              1~2℃ 낮춘다.
             . extension 온도를 68~72℃ 내에서 낮추고,반응시간을 좀 줄인다.
              DNA template 길이가 1kb이상이면 0.5~1 min/kb 범위에서 다소
              줄이고, 20 cycle이후에서 매 cycle당 10~20sec.씩 늘린다.
- PCR target band는 잘 나오나 끌림 현상이 심할 때,
             . DNA template and/or Primers 사용량을 좀 줄인다.
             . PCR반응온도 and/or 반응시간을 줄인다.
             . PCR tube 준비 시에 필히 ice bath를 사용한다.
             . Agarose Gel에 loading한 PCR product 양이 너무 많지 않은지?

3. PCR band가 약할 때 :

..... 이하 생략.  제품 매뉴얼 참조 .....